Šunų klinikinių mėginių parvovirusų VP-2 geno filogenetiniai tyrimai ir molekulinės biologijos lyginamoji analizė

Ištrauka

Šunų klinikinių mėginių parvovirusų VP-2 geno filogenetiniai tyrimai ir molekulinės biologijos lyginamoji analizė
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS

TURINYS
SANTRAUKA 5
SUMMARY 6
SANTRUPOS 7
ĮVADAS 8
1. LITERATŪROS APŽVALGA 10
1.1. Epidemiologiniai duomenys 10
1.2. Rizikos faktoriai 10
1.3. Viruso šeimininkai/rezervuarai 10
1.4. Šunų parvovirusai kačių populiacijoje 11
1.5. Motininiai antikūniai 11
1.6. Prevencija 12
1.7. Parvovirusų atžvilgiu taikoma kontrolė 12
1.8. Parvoviruso genetinė sandara 13
1.9. VP-2 geno funkcija ir diagnostinė reikšmė 13
1.10. Parvovirusinės infekcijos laboratorinės diagnostikos metodai 14
1.10.1 Imunochromatografiniai tyrimai 14
1.10.2. Hemagliutinacija 15
1.10.3. Elektronų mikroskopija 15
1.10.4. Imunofermentinė analizė 15
1.10.5. Viruso izoliacija 15
1.10.6. Latekso agliutinacijos testas 15
1.10.7. Polimerazės grandininė reakcija 16
1.10.8. Realaus laiko PGR 16
1.10.9. Filogenetinė analizė 17
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA 18
2.1. Klinikiniai ir epidemiologiniai tyrimai 18
2.2. Patologinės medžiagos mėginių ėmimas 19
2.3. Mėginių paruošimas PGR analizei 20
2.3.1 Viruso DNR išskyrimas 20
2.3.2. Parenkami primeriai, PGR 20
2.3.3. Agarozės gelio elektroforezė ir PGR produktų gryninimas 21
2.3.4. DNR sekvenavimas ir filogenetinė analizė 21
3. REZULTATAI 24
REZULTATŲ APTARIMAS 32
IŠVADOS 34
LITERATŪROS SĄRAŠAS 35

ĮVADAS
Šunų parvovirusų 2 tipas (ŠPV-2) pirmą kartą užfiksuotas 1978 metais. Per artimiausius
dešimt metų ŠPV-2 sukėlė pandemijas įvairiose šalyse, kurios pasireiškė sunkiais gastroenterito
klinikiniais požymiais. Dėl santykinai greitos ŠPV-2 viruso evoliucijos, visame pasaulyje atsirado
įvairių genetinių ir antigeninių viruso variantų, kurie pavadinti subtipais: subtipu 2a (ŠPV-2a),
subtipu 2b (ŠPV-2b) ir subtipu 2c (ŠPV-2c) (1,4-6,16-18).
ŠPV-2 virionai dažniausiai persiduoda fekaliniu – oraliniu keliu, per infekuotų šunų išmatas.
Patekęs virusas į šeimininko organizmą pradeda daugintis mitotiškai aktyviuose audiniuose: žarnų
epitelyje, kaulų čiulpuose, naujagimių širdyse. Inkubacinis periodas trunka nuo 3 iki 7 dienų
(1,13,19,21). Klinikiniai požymiai panašūs naminiams ir laukiniams gyvūnams: vėmimas, kraujinga
diarėja, leukopenija, apatiškumas, hipertermija/hipotermija (1,13,19). Sergamumas gali siekti iki
100 proc., mirtingumas gali siekti 10,0 - 91,0 proc. Infekcija gali pasireikšti vakcinuotuose ir
nevakcinuotuose šunyse (26). Apsaugai nuo infekcijos ypač svarbų vaidmenį atlieka motininiai
antikūniai, kurie kovoja su į organizmą patekusiu virusu. Infekcija dažniausiai pasireiškia po to, kai
motininių antikūnių kiekis sumažėja organizme, dažniausiai 2-4 mėn. šuniukams (39). Dėl didelio
cirkuliuojančių motininių antikūnių titro organizme po vakcinacijos sutrikdomas aktyvaus imuniteto
susiformavimas (46). Šunų parvovirusų VP-2 genas – tai struktūrinis baltymas, kuris yra atsakingas
už virusinį ląstelių topizmą. Pasaulyje vyraujančiuose šunų parvovirusų skirtingose subtipuose
(ŠPV-2a, ŠPV-2b, ŠPV-2c) VP-2 gene pastebimas santykinai aktyvus aminorūgščių struktūrinės
kaitos laipsnis, kuris tiesiogiai įtakoja skirtingų virusų antigeniškumo savybes (15).
Apie Lietuvoje šunų parvovirusų (ŠPV-2) sukeltus hemoraginio enterito atvejus pirmą kartą
pranešta 1995 - 1996 metais, vėliau 2002 metais tyrimai buvo tęsiami, tačiau buvo apsiribota
epidemiologinės analizės duomenimis (32,33). Esant santykinai greitai parvovirusų filogenetinei
evoliucijai, šių virusų VP-2 geno atliekami moksliniai tyrimai yra labai aktualūs, siekiant įvertinti
ŠPV-2 antigeninių savybių tyrimus skirtinguose regionuose ir skirtingais tyrimo periodais. Šiame
magistriniame darbe ištyrėme lietuviškų klinikinių mėginių ŠPV-2 VP-2 genų dalinio sekvenavimo
produktų molekulinę struktūrą ir filogenetiškai palyginome produktų sekų giminingumo laipsnius
su kitų pasaulio šalių parvovirusų, vakcinų, KPV referentinėmis VP-2 genų sekomis panaudojant
MEGAX kompiuterinio modeliavimo programą.

Darbo tikslas: Atlikti parvovirusų VP-2 geno dalinio sekvenavimo sekų filogenetinius
palyginamuosius tyrimus iš surinktų šunų klinikinių mėginių, panaudojant filogenetinės analizės
MEGAX kompiuterinio modeliavimo programą.
Darbo uždaviniai:
1.Atlikti parvovirusinės infekcijos diagnostinius tyrimus (PGR) VP-2 geno daliniame regione ir
identifikuoti reakcijos produktus.
2.Įvertinti natyvinių parvovirusųVP-2 geno dalinio sekvenavimo rezultatusir paruošti
filogenetinių tyrimų ataskaitą MEGAX kompiuterinio modeliavimo programa.
3.Atlikti lietuviškų šunų parvovirusų VP-2 geno dalinio sekvenavimo produktų duomenų statistinę
analizę SPSS programa.