SKIRTINGŲ GLIKOZILINIMO MODELIŲ ĮTAKA VII FAKTORIAUS BIOLOGINIAM AKTYVUMUI

Ištrauka

SKIRTINGŲ GLIKOZILINIMO MODELIŲ ĮTAKA VII FAKTORIAUS BIOLOGINIAM AKTYVUMUI

TURINYS
ĮVADAS 3
2. METODAI 4
2.1 hVII faktoriaus paruošimas autoaktyvacijai 4
2.2 rhFVIICHO ir rhFVIIBHK glikozilinimo analizė 4
2.3 FVII ir TF komplekso paviršiaus plazmonų rezonanso tyrimas 4
2.4 TFAP relipidacija 4
2.5 FVII autoaktyvacija ir duomenų analizė 5
2.6 FVIIa amidolitinio aktyvumo tyrimas 5
2.7 FVII RP-HPLC analizė 5
3. REZULTATAI IR DISKUSIJA 5
3.1 rhFVIICHO ir rhFVIIBHK glikozilinimo profiliai 5
3.2 VII faktoriaus sąveika su TF naudojant SPR 6
3.3 FVII autoaktivacijos kinetika 9
3.4 FVII faktoriaus autoaktyvicijos tyrimo kūrimas ir galiojimas/veikimas 9
3.5 FVII autoaktyvacijos greičios konstantų nustatymas 11
4. IŠVADOS 14

1. ĮVADAS
VII faktorius yra kepenų sintetintas vienos grandines nuo kalio priklausomas glikopriteinas,
cirkuliuojantis žmogaus organizme kofermento forma. Kofermentas fiziologiškai paverčiamas į dviejų grandžių
aktyvią, nuo kalcio priklausomą serino proteazę, nutraukiant Arg ir Ile peptidines jungtis Xa ir IXa faktoriais.
Trombinas ar autokatalizuojantis VIIa faktorius jungiasi prie transmembraninio glikoproteino audinių
faktoriaus (TF), kuris yra ląstelinis receptorius ir kofaktorius, aptinkamas kraujagyslių endotelyje. Jis yra
išskiriamas į kraują esant kraujagyslių pažeidimui. FVIIa faktorius yra silpnas fermentas, bet po susirišimo su
glikoproteino audinių faktoriumi, FVIIa faktoriaus serino proteazės aktyvumas sustiprėja. Jungimasis su
glikoproteino audinių faktoriumi yra esminis procesas kraujo krešėjimo procese.
VII faktorius yra postrancliacijos budu glikozilintas keturiose vietose, iš kūrių dviejose yra Ser52 ir
Ser60 O-glikozilinimas, kurie yra pirmame EFG domene, kuris yra pagrindinis siekiant stabilizuoti TF-VII
kompleksą. Kitose vietose yra Asn145 ir Asn322 N-glikozilinimas, kurios yra antrame EFG domaine su
protezės domenu. Protezės domene Ser52 susideda iš triejų skirtingai O-glikozilintų glikanų struktūrų –
gliukozė, gliukozė-ksilozė, gliukozė-(ksilozė)2.
Įrodyta, kad rekombinantinis žmogaus VII faktorius yra puiki alternatyva kraujavimo stabdymui
hemofilija sergantiems žmonėms. Rekombinantinis VII faktorius gaminamas BHK ląstelių kultūroje, kur įgyja
šiek tiek skirtingą glikozilinimo modelį, lyginant su žmogaus plazmos VII faktoriumi – skiriasi O-glikozilintu
struktūrų kiekiu prie Ser52. Rekombinantinio VII faktoriaus N-glikozilinimo vietos turi daugiau fukozės ir
mažiau seilių r. struktūrų. Tačiau, O-glikozilinimas buvo anksčiau tirtas analizuojant perdirbtus FVII analogus,
kur Ser52 ir Ser60 likučiai yra pakeisti alaninu, arba glikozilintais ar neglikozilintais VII faktoriaus
fragmentais. Mokslininkai pastebėjo, kad dar nebuvo atliktas lyginamasis VII krešėjimo faktoriaus variantų
tyrimas, turint skirtingus glikozilinimo modelius. Taigi, pagrindinis šio tyrimo tikslas yra palyginti skirtingų
glikozilinimo modelių FVII krešėjimo faktorių biologinį aktyvumą: jungimasį prie TF ir autoaktyvacijos
kinetiką. Tyrime mokslininkai pasirinko naudoti žmogaus plazmos FVII faktorių, rekombinantinį žmogaus
CHO ląstelių kultūros produkuotą FVII faktorių ir rekombinantini žmogaus BHK ląstelių kultūros produkuotą
FVII krešėjimo faktorių.