Atšildytos bulių spermos kapacitacijos tyrimas in vitro

Ištrauka

Atšildytos bulių spermos kapacitacijos tyrimas in vitro
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS

Turinys
SANTRUMPOS 3
SANTRAUKA 4
Master‘s Thesis 5
SUMMARY 5
ĮVADAS 6
1. LITERATŪROS APŽVALGA 7
1.1. Bulių spermatozoidų sandara ir savybės 7
1.2. Biocheminiai ir fiziologiniai spermatozoido pasikeitimai kapacitacijos metu 8
1.3. Kapacitacija in vivo 9
1.4. Kapacitacija in vitro 10
1.5. Spermatozoidų kriokonservavimo įtaka spermatozoidų judrumui 11
1.6. Kapacitacijos įtaka judrumui 11
1.7. Su kapacitacija susijusi akrosominė būklė 12
1.8. Akrosominė būklė kapacitacijos metu ir jos įvertinimo metodai 13
1.9. Kiaušialąščių paruošimas apsivaisinimui in vitro 13
1.10. In vitro apvaisinimas 15
2. MEDŽIAGOS IR METODAI 17
2.1. Pagrindinė bandymų schema 17
2.2. Atšildytos spermos paruošimas tyrimams 18
2.3. Kiaušialąščių tyrimas 18
2.4. Apvaisinimo in vitro tyrimas 18
2.5. Tyrimus reglamentuojantys įstatymai 19
2.6. Duomenų statistinė analizė 19
3. TYRIMŲ REZULTATAI 20
3.1. Spermatozoidų vaizdas, nudažius juos su Trypan blue dažais 20
3.2. Akrosominės būklės įvertinimas dažant spermatozoidus su Trypan blue dažais 21
3.3. Spermatozoidų, kapacituotų 60 minučių, judrumo nustatymas po skirtingų centrifugavimų 21
3.4. Spermatozoidų, kapacituotų 120 minučių, judrumo nustatymas po skirtingų 
centrifugavimų 22
3.5. COCs kompleksų pasiskirstymo nustatymas 23
3.6. Spermatozoidų, kapacituotų 60 min. ir 120 min., apvaisinimo procentas in vitro naudojant 
skirtingų tipų kiaušialąstes 24
4. REZULTATŲ APTARIMAS 25
5. IŠVADOS 27
REKOMENDACIJOS 28
PADĖKA 29
LITERATŪROS ŠALTINIAI 30

ĮVADAS
Įvairūs metodai su naminių gyvūnų gametomis bei spermatozoidais in vitro šiuo metu
yra labiausiai pažengę biotechnologiniai metodai galvijų reprodukcijoje (8). Šiuo metu
Lietuvoje telyčioms ir karvėms apsėklinti yra naudojama kriokonservuota-šiaudeliuose
įšaldyta sperma, paiimta iš veislinių bulių (31). Tinkamam apvaisinimui tiek in vivo tiek in
vitro spermatozoidai turi įgauti progresinį judėjimą ir apvaisinimo galimybę. Spermatozoidai
turi pereiti svarbius biocheminius ir fiziologinius procesus, kurie vadinami kapacitacija (1).
Spermatozoidų kapacitacija įtraukia du svarbius procesus pavadinimu hiperaktyvacija ir
akrosominė reakcija (2). Šie procesai yra pamatas spermatozoidų gebėjimu apvaisinti
kiaušialąstę. Tik kapacitavę spermatozoidai turi išskirtinę galimybę vykdyti akrosominę
reakciją ir prasiskverbti į kiaušialąstę (18).
Atšildyta bulių sperma turi mažesnį procentinį spermatozoidų judrumą (30 proc.–70
proc.), todėl specialus dėmesys turėtų būti skiriamas spermatozoidų paruošimui procesams in
vitro (13). Būtina sąlyga efektyviam apvaisinimui in vitro yra pakankamas kiekis kapacituotų
judrių spermatozoidų, kurie galėtų apvaisinti kiaušialąstę.Vienas iš dažniausiai naudojamų
metodų, norint atskirti judrius spermatozoidus iš atšildytos spermos, yra praplovimas. Šis
metodas leidžia atskirti gyvybingus spermatozoidus, kurių akrosoma nėra pažeista (16).
Centrifugavimas yra vienas iš lengviausių ir dažniausiai naudojamų spermatozoidų
atskyrimo metodų. Judrių spermatozoidų skaičius priklauso nuo centrifugavimo sąlygų.
Vienas iš svarbiausių tikslų yra išsiaiškinti kaip kapacitacijos trukmė bei centrifugavimas yra
susijęs su spermatozoidų judrumu, akrosomine būkle ir galimybe apvaisinti kiaušialąstę in
vitro (11).
Darbo tikslas:
Ištirtikapacitacijos ekspozicijos (laiko)įtaką spermatozoidų judrumui,akrosomos būklei ir
gebėjimui apvaisinti in vitro.
Uždaviniai:
1.Nustatyti kapacitacijos ekspozicijos laiko ir centrifugavimo įtaką spermatozoidų judrumui;
2.Nustatyti kapacitacijos ekspozicijos laiko įtaką spermatozoidų akrosomos būklei;
3.Nustatyti kapacitacijos ekspozicijos laiko įtaką spermatoidų gebėjimui apvaisinti in vitro;