TUDS IR DUF1722 DOMENUS TURINČIO BALTYMO TYRIMAS

Ištrauka

Biochemija 
Bakalauro baigiamasis darbas
TUDS IR DUF1722 DOMENUS TURINČIO BALTYMO TYRIMAS

TURINYS
SANTRUMPŲ SĄRAŠAS 5
ĮVADAS 6
1. LITERATŪROS APŽVALGA 7
1.1 tRNR molekulės struktūra ir funkcija 7
1.2 tRNR modifikacijos ir jų funkcijos 8
1.3 Modifikacijos sierà 10
1.4 Modifikacijų klinikinė reikšmė 10
1.5 4-tiouridino biosintezė 11
1.6 4-tiouridino atliekamos funkcijos 12
1.7 4-tiouridino katabolizmas 12
1.8 4-tiouridino panaudojimas biotechnologijoje 14
1.9 Modifikacijų aptikimas ir tyrimai 14
2. TYRIMO PRIEMONĖS IR METODAI 16
2.1 Reagentai ir rinkiniai 16
2.2 Prietaisai 17
2.3 Bakterijų kamienai 17
2.4 Mitybinės terpės ir tirpalai 17
2.5 Oligonukleotidų pradmenys 18
2.6 Tyrimo metodai 20
2.6.1 DNR amplifikacija PGR metodu 20
2.6.2 Tikslinė mutagenezė 20
2.6.3 DNR elektroforezė agaroziniame gelyje 21
2.6.4 DNR fragmentų išskyrimas iš agarozinio gelio 21
2.6.5 Rekombinantinės DNR konstravimas 21
2.6.6 Kompetentinių ląstelių auginimas, cheminė transformacija 22
2.6.7 Plazmidžių išskyrimas iš bakterinių ląstelių kultūros 22
2.6.8 Rekombinantinių baltymų sintezė tRNR tyrimams 22
2.6.9 Rekombinantinių baltymų sintezė baltymų gryninimui 22
2.6.10 Ląstelių ardymas ultragarsiniu dezintegratoriumi 23
2.6.11 Rekombinantinio baltymo gryninimas skysčių chromatografija 23
2.6.12 SDS-PAGE baltymų elektroforezė 23
2.6.13 Elektroforezinio judrumo poslinkio tyrimas ir RNR elektroforezė 24
2.6.14 tRNR išskyrimas 24
2.6.15 tRNR gryninimas skysčių chromatografija 24
2.6.16 tRNR hidrolizė 25
2.6.17 Didelio efektyvumo skysčių chromatografija-tandeminė masių spektrometrija 25
2.6.18 Baltymų koncentracijos nustatymas Bradford metodu 25
2.6.19 Western blot 26
3. Tyrimo rezultatai ir jų aptarimas 27
3.1 TudS-DUF1722-KT aktyvumo tyrimas in vivo 27
3.1.1 Plazmidinių vektorių konstravimas 27
3.1.2 tRNR gryninimo efektyvumo įvertinimas 28
3.1.3 TudS-DUF1722-KT aktyvumo tyrimas HPLC-MS/MS 29
3.2 TudS-DUF1722-KT aktyvumo tyrimas in vitro 30
3.2.1 Plazmidinio vektoriaus konstravimas 30
3.2.2 Heterologinė TudS-DUF1722-KT geno raiška ir baltymo gryninimas 31
3.2.3 TudS-DUF1722-KT sąveikos su tRNR tyrimas 32
3.3 TudS-DUF1722-KT baltymų su aminorūgščių pakeitimais aktyvumo tyrimas 33
3.4 TudS-DUF1722-KT sintezės palyginimas naudojant pLATE11 ir pLATE52 vektorius 34
3.4.1 TudS-DUF1722-KT aktyvumo palyginimas skirtinguose vektoriuose 35
3.4.2 Skirtingai indukuotų TudS-DUF1722-KT kiekio nustatymas 36
3.5 TudS-DUF1722-KT su aminorūgščių pakeitimais kiekių nustatymas 37
IŠVADOS 39
SANTRAUKA 40
SUMMARY 41
LITERATŪROS SĄRAŠAS 42
PRIEDAI 46

ĮVADAS
Baltymų sintezė – procesas, vykstantis visuose gyvuosiuose organizmuose. Jame dalyvauja
gausybė biomolekulių, tarp jų ir transportinės RNR (tRNR). Tai molekulės, kurių pagrindinė
funkcija yra transportuoti aminorūgštis į ribosomas transliacijos metu. Tam, kad tRNR gebėtų
efektyviai atlikti savo funkciją, jos turi įgyti specifinę erdvinę struktūrą, kurią padeda palaikyti
potranskripcinės cheminės modifikacijos. Be struktūros palaikymo, cheminės modifikacijos taip pat
užtikrina efektyvią baltymų transliaciją ir yra svarbios tiksliam informacinės RNR (iRNR) kodonų
nuskaitymui. Be to, kai kurios tRNR modifikacijos gali veikti ir kaip ląstelės streso jutikliai.
Lyginant su kitais RNR tipais, tRNR pasižymi pačia didžiausia nukleozidų modifikacijų
įvairove ir tankiu – vienoje tRNR molekulėje yra vidutiniškai 13 modifikacijų, o iš viso šiuo metu
jau nustatyta virš 170 natūraliai sutinkamų RNR modifikacijų. Šio darbo objektas susijęs su viena iš
tRNR cheminių modifikacijų – 4-tiouridinu (s4U), aptinkamu 8-toje bakterijų ir archėjų tRNR
pozicijoje. s4U padeda palaikyti tRNR tretinę struktūrą ir yra jautrus ultravioletinei (UV)
spinduliuotei. Ląstelę apšvietus UV, s4U gali jungtis (angl. crosslink) su kitomis tRNR
molekulėmis ar baltymais, kas sukelia atsaką į stresą – yra įjungiami tam tikri metaboliniai keliai,
kurie atstato ląstelės patirtą žalą. Taigi, s4U ne tik palaiko tiesioginę tRNR funkciją, bet ir įgalina
šią molekulę dalyvauti ląstelės reguliavimo procesuose.
tRNR modifikacijų biosintezės keliai yra pakankamai gerai ištyrinėti, tačiau apie jų
katabolizmą ir jame dalyvaujančius fermentus kol kas žinoma nedaug.
Manoma, jog bakterijose iš degradavusių tRNR molekulių kilę s4U monofosfatai yra
perdirbami į uridino monofosfatus ir grąžinami į ląstelės metabolizmą. Tą atlieka fermentai
tiouracilo desulfidazės (TudS). Didžioji dalis šių baltymų turi tik vieną domeną, tačiau...