Transfekuotų genų raiškos reguliacija žinduolinėse ląstelėse

Ištrauka

Magistro darbas
Transfekuotų genų raiškos reguliacija žŽinduolinėse ląstelėseų raiškos vektorių konstravimas ir savybių tyrimas

TURINYS
SANTRUMPOS 25
ĮVADAS 66
1. LITERATŪROS APŽVALGA 7
1.1. Genų raiškos reguliacija 773
1.1.1. iRNR sintezės pradėtis 884
1.1.2. iRNR sintezės pradėtį kontroliuojantys baltymai 995
1.1.3. iRNR sintezės pradėtį kontroliuojančios genų sekos 9105
1.2. Promotoriaus sekos 17111
1.2.1. Tiriami promotoriai 18213
1.3. Plazmidės pristatymas į branduolį 1612
1.4. Transfekuoto geno raiška ląstelėse 171.4. Transfekuoto geno raiška ląstelėse
1612
1.4.1. Tiriamos žinduolinių ląstelių linijos 13723
1.5. Plazmidinių vektorių taikymas 162021
2. PRIEMONĖS IR METODAI 23
2.1. Darbui naudoti prietaisai ir medžiagos 23
2.2.1. Prietaisai 23
2.2.2. Medžiagos 23
2.3. Metodai 27
2.3.1. Kompetentinių E. coli ląstelių transformacija 27
2.3.2. DNR elektroforezė 28
2.3.3. RNR elektroforezė 28
2.3.4. Baltymų elektroforezė dalinai natyviomis sąlygomis 28
2.3.5. PGR 29
2.3.6. Kolonijų PGR 29
2.3.7. Tikro laiko PGR 29
2.3.8. DNR gryninimas 29
2.3.9. RNR gryninimas 30
2.3.10. kDNR sintezė 31
2.3.11. DNR hidrolizė restrikcijos endonukleazėmis 31
2.3.12. DNR galų modifikavimas 31
2.3.13. DNR fragmentų susiuvimas 32
2.3.14. DNR žymėjimas FLUOR-ULS dažu 32
2.3.15. Dalelių dydžio matavimas 32
2.3.16. Eukariotinių ląstelių auginimas 32
2.3.17. Eukariotinių ląstelių skaičiaus nustatymas 33
2.3.18. Plazmidinės DNR transfekcija į eukariotines ląsteles 33
2.3.19. Eukariotinių ląstelių paruošimas tėkmės citometrijai 33
2.3.20. Baltymų išskyrimas iš ląstelių 34
2.3.21. Baltymų koncentracijos matavimas 34
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS 35
3.1. Vektorių konstravimas 35
3.2. Vektorių transfekcija 36
3.2.1. Polipleksų dydžio matavimai 36
3.2.2. Optimalaus transfekcijos agento kiekio parinkimas 37
3.2.3. Įvairių ląstelių linijų transfekcijos efektyvumo matavimai 38
3.2.4. Polipleksų patekimo į ląsteles tyrimai 42
3.3 Plazmidžių kopijų skaičiaus ląstelėse nustatymas 42
3.4. iRNR kopijų skaičiaus ląstelėse nustatymas 44
3.5. eGFP baltymo kiekio ląstelėse nustatymas 45
3.6. Rezultatų aptarimas 46
IŠVADOS 49
SUMMARY 50
LITERATŪROS SĄRAŠAS 51LITERATŪROS SĄRAŠAS
19

ĮVADAS
Žinduolių raiškos vektoriai yra plačiai naudojami molekulinės ir ląstelės biologijos
moksle, juos taip pat galima taikyti medicinoje, pavyzdžiui, genų terapijoje. Tobulėjant genų
perkėlimo metodams, ypatingas dėmesys kreipiamas žinduolinių ląstelių transfekcijoms,
siekiama greitos rekombinantinių baltymų produkcijos (Carpentier, 2007). Žinduolių ląstelės
yra tinkamos svetimų genų raiškai, kadangi turi konservatyvius raiškos signalus, kurie
sintezės metu užtikrina tinkamą baltymų susisukimą ir teisingą baltymų modifikaciją
(Kaufman, 2000). Eukariotinėse ląstelėse genai yra griežtai reguliuojami, dėl to sėkminga,
maksimali jų raiška priklauso nuo tinkamo promotoriaus ir papildomų reguliacinių elementų
parinkimo (Papadakis et al., 2004). Nuo daugelio pastaruoju metu naudojamų stiprių
promotorių vykdomos RNR sintezės lygis priklauso nuo ląstelinio fono (Michael et al., 2009).
Nemažai tyrimų yra atlikta tiriant promotorių stiprumą skirtingomis ląstelių kultivavimo
sąlygomis, tačiau trūksta sistemingos promotorių veikimo analizės skirtinguose ląstelių
tipuose tomis pačiomis eksperimento sąlygomis. Naudojamas promotorius dažniausiai
pasirenkamas atsitiktinai, pagal technines galimybes, o ne pagal tinkamumą konkrečiam
eksperimentui (Quin et al., 2010).
Tam, kad būtų galima racionaliai pasirinkti promotorių transgeno raiškai, šiame darbe
tiriamas šešių žinduolinėse ląstelėse dažnai naudojamų konstitutyvių promotorių veikimas.
Kad rezultatai kuo pilniau atspindėtų promotorių veikimo galimybes, – jie tiriami skirtinguose ląstelių tipuose.
Darbo tikslas: Optimalios raiškos sistemos paieška skirtingose žinduolių ląstelių linijose.
Darbo uždaviniai:
1. Sukonstruoti raiškos vektorius su skirtingais promotoriais;
2. Palyginti tikslinio baltymo raišką nuo skirtingų promotorių atliekant transfekcijas ir nustatant:
Transfekcijos efektyvumą;
Plazmidžių kopijų skaičių ląstelėse;
iRNR kopijų skaičių ląstelėse;
Pagamaninto baltymo kiekį ląstelėse.

1. 1. LITERATŪROS APŽVALGA
Genų raiškos reguliacija
Organizmuose egzistuoja keletas genų raiškos reguliacijos lygių (1.1 pav). Eukariotinių
genų raiškos kontrolė pirmiausia vyksta transkripcijos pradėties lygmenyje. Šią kontrolę
vykdo baltymai, prisijungiantys prie specifinių reguliacinių sekų ir keičiantys RNR
polimerazės aktyvumą (Cooper, 2000). Koordinuotiems RNR sintezės kompleksams
susirinkti reikia daugybinių promotoriaus ir stipriklio sekos elementų, didelio skaičiaus prie
DNR besijungiančių sekai specifinių baltymų, taip pat reikalingas chromatino remodeliavimas
bei jį modifikuojantys veiksniai. Visa tai prisideda prie eukariotinių genų raiškos...