Transfekuotų genų raiškos reguliacija žinduolinėse ląstelėse

Ištrauka

Magistro darbas
Transfekuotų genų raiškos reguliacija žŽinduolinėse ląstelėseų raiškos vektorių konstravimas ir savybių tyrimas

TURINYS
SANTRUMPOS........................................................................................................................25
ĮVADAS ....................................................................................................................................66
1. LITERATŪROS APŽVALGA ...............................................................................................7
1.1. Genų raiškos reguliacija...............................................................................................773
1.1.1. iRNR sintezės pradėtis...........................................................................................884
1.1.2. iRNR sintezės pradėtį kontroliuojantys baltymai..................................................995
1.1.3. iRNR sintezės pradėtį kontroliuojančios genų sekos..........................................9105
1.2. Promotoriaus sekos..................................................................................................17111
1.2.1. Tiriami promotoriai...........................................................................................18213
1.3. Plazmidės pristatymas į branduolį..............................................................................1612
1.4. Transfekuoto geno raiška ląstelėse ..................171.4. Transfekuoto geno raiška ląstelėse
...........................................................................................................................................1612
1.4.1. Tiriamos žinduolinių ląstelių linijos..................................................................13723
1.5. Plazmidinių vektorių taikymas...............................................................................162021
2. PRIEMONĖS IR METODAI ............................................................................................23
2.1. Darbui naudoti prietaisai ir medžiagos ...........................................................................23
2.2.1. Prietaisai ......................................................................................................................23
2.2.2. Medžiagos ...................................................................................................................23
2.3. Metodai ...........................................................................................................................27
2.3.1. Kompetentinių E. coli ląstelių transformacija .............................................................27
2.3.2. DNR elektroforezė .....................................................................................................28
2.3.3. RNR elektroforezė .......................................................................................................28
2.3.4. Baltymų elektroforezė dalinai natyviomis sąlygomis .................................................28
2.3.5. PGR ............................................................................................................................29
2.3.6. Kolonijų PGR .............................................................................................................29
2.3.7. Tikro laiko PGR ..........................................................................................................29
2.3.8. DNR gryninimas ........................................................................................................29
2.3.9. RNR gryninimas ..........................................................................................................30
2.3.10. kDNR sintezė ............................................................................................................31
2.3.11. DNR hidrolizė restrikcijos endonukleazėmis ............................................................31
2.3.12. DNR galų modifikavimas ............................................................................................31
2.3.13. DNR fragmentų susiuvimas ..........................................................................................32
2.3.14. DNR žymėjimas FLUOR-ULS dažu ............................................................................32
2.3.15. Dalelių dydžio matavimas ............................................................................................32
2.3.16. Eukariotinių ląstelių auginimas .....................................................................................32
2.3.17. Eukariotinių ląstelių skaičiaus nustatymas ..................................................................33
2.3.18. Plazmidinės DNR transfekcija į eukariotines ląsteles .................................................33
2.3.19. Eukariotinių ląstelių paruošimas tėkmės citometrijai ...................................................33
2.3.20. Baltymų išskyrimas iš ląstelių ......................................................................................34
2.3.21. Baltymų koncentracijos matavimas ..............................................................................34
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ...................................................................................35
3.1. Vektorių konstravimas .......................................................................................................35
3.2. Vektorių transfekcija ..........................................................................................................36
3.2.1. Polipleksų dydžio matavimai .........................................................................................36
3.2.2. Optimalaus transfekcijos agento kiekio parinkimas ......................................................37
3.2.3. Įvairių ląstelių linijų transfekcijos efektyvumo matavimai ..........................................38
3.2.4. Polipleksų patekimo į ląsteles tyrimai ..........................................................................42
3.3 Plazmidžių kopijų skaičiaus ląstelėse nustatymas ..............................................................42
3.4. iRNR kopijų skaičiaus ląstelėse nustatymas ......................................................................44
3.5. eGFP baltymo kiekio ląstelėse nustatymas .......................................................................45
3.6. Rezultatų aptarimas ............................................................................................................46
IŠVADOS .................................................................................................................................49
SUMMARY ..........................................................................................................................50
LITERATŪROS SĄRAŠAS ......................................................51LITERATŪROS SĄRAŠAS
...................................................................................................................................................19

ĮVADAS
Žinduolių raiškos vektoriai yra plačiai naudojami molekulinės ir ląstelės biologijos
moksle, juos taip pat galima taikyti medicinoje, pavyzdžiui, genų terapijoje. Tobulėjant genų
perkėlimo metodams, ypatingas dėmesys kreipiamas žinduolinių ląstelių transfekcijoms,
siekiama greitos rekombinantinių baltymų produkcijos (Carpentier, 2007). Žinduolių ląstelės
yra tinkamos svetimų genų raiškai, kadangi turi konservatyvius raiškos signalus, kurie
sintezės metu užtikrina tinkamą baltymų susisukimą ir teisingą baltymų modifikaciją
(Kaufman, 2000). Eukariotinėse ląstelėse genai yra griežtai reguliuojami, dėl to sėkminga,
maksimali jų raiška priklauso nuo tinkamo promotoriaus ir papildomų reguliacinių elementų
parinkimo (Papadakis et al., 2004). Nuo daugelio pastaruoju metu naudojamų stiprių
promotorių vykdomos RNR sintezės lygis priklauso nuo ląstelinio fono (Michael et al., 2009).
Nemažai tyrimų yra atlikta tiriant promotorių stiprumą skirtingomis ląstelių kultivavimo
sąlygomis, tačiau trūksta sistemingos promotorių veikimo analizės skirtinguose ląstelių
tipuose tomis pačiomis eksperimento sąlygomis. Naudojamas promotorius dažniausiai
pasirenkamas atsitiktinai, pagal technines galimybes, o ne pagal tinkamumą konkrečiam
eksperimentui (Quin et al., 2010).
Tam, kad būtų galima racionaliai pasirinkti promotorių transgeno raiškai, šiame darbe
tiriamas šešių žinduolinėse ląstelėse dažnai naudojamų konstitutyvių promotorių veikimas.
Kad rezultatai kuo pilniau atspindėtų promotorių veikimo galimybes, – jie tiriami skirtinguose ląstelių tipuose.
Darbo tikslas: Optimalios raiškos sistemos paieška skirtingose žinduolių ląstelių linijose.
Darbo uždaviniai:
1. Sukonstruoti raiškos vektorius su skirtingais promotoriais;
2. Palyginti tikslinio baltymo raišką nuo skirtingų promotorių atliekant transfekcijas ir nustatant:
Transfekcijos efektyvumą;
Plazmidžių kopijų skaičių ląstelėse;
iRNR kopijų skaičių ląstelėse;
Pagamaninto baltymo kiekį ląstelėse.

1. 1. LITERATŪROS APŽVALGA
Genų raiškos reguliacija
Organizmuose egzistuoja keletas genų raiškos reguliacijos lygių (1.1 pav). Eukariotinių
genų raiškos kontrolė pirmiausia vyksta transkripcijos pradėties lygmenyje. Šią kontrolę
vykdo baltymai, prisijungiantys prie specifinių reguliacinių sekų ir keičiantys RNR
polimerazės aktyvumą (Cooper, 2000). Koordinuotiems RNR sintezės kompleksams
susirinkti reikia daugybinių promotoriaus ir stipriklio sekos elementų, didelio skaičiaus prie
DNR besijungiančių sekai specifinių baltymų, taip pat reikalingas chromatino remodeliavimas
bei jį modifikuojantys veiksniai. Visa tai prisideda prie eukariotinių genų raiškos kontrolės
kompleksiškumo (Cooper, 2000; Verger ir Crossley, 2006).
1.1 pav. Pagrindiniai genų reguliacijos žingsniai...