Funkcionalizuotų m-terfenilų sintezė, modifikacija ir chemofermentinis atropoizomerų atskyrimas

Ištrauka

Bakalauro baigiamasis darbas
Funkcionalizuotų m-terfenilų sintezė, modifikacija ir chemofermentinis atropoizomerų atskyrimas

TURINYS
TRUMPINIAI 6
ĮVADAS 7
1. LITERATŪROS APŽVALGA 8
1.1. Fluorinti aromatiniai junginiai 8
1.1.1. Klasikinė fluorintų (hetero)aromatinių junginių sintezė 8
1.1.2. Paladžio (0/II) katalizės pritaikymas C(sp2)-F kryžminio jungimo reakcijose 8
1.2. Ašinis chirališkumas, atropoizomerija 11
1.2.1. Atropoizomerija katalizėje 11
1.2.2. Ašinis chirališkumas biologijoje 12
1.2.3. Ašinių enantiomerų atskyrimas 13
1.3. Karboksilesterazės 14
1.3.1. Alfa/beta hidrolazių struktūra ir veikimo mechanizmas 15
1.3.2. Lipazių „dangčio“ motyvas 16
1.3.3. Lipazė iš Rhizomucor meihei 17
1.3.4. Lipazių pritaikymas atropoizomerų atskyrimui 17
2. REAGENTAI IR ĮRANGA 19
2.1. Įranga biocheminiams darbams 19
2.2. Rinkiniai 20
2.3. Tirpalai ir reagentai 20
2.4. Kamienai 21
2.5. DNR vektoriai 21
2.6. Auginimo terpės 21
2.7. Pradmenys 22
3. METODAI 23
3.1.2-Bromo-1,3,5-triizopropilbenzeno (15) sintezė 23
3.2.2,3,4,5,6-Pentafluoro-2',4',6'-triizopropil-1,1'-bifenilo (16) sintezė 23
3.3.4-Butil-2,3,5,6-tetrafluoro-2',4',6'-triizopropil-1,1'-bifenilo (17) sintezė 24
3.4.4-Butil-2,3,5,6-tetrafluoro-3'-jodo-2',4',6'-triizopropil-1,1'-bifenilo (18) sintezė 24
3.5.4-Butil-2,3,5,6-tetrafluoro-2''-jodo-2',4',6'-triizopropil-3''-metoksi-1,1':3',1''-terfenilo
(19)sintezė 25
3.6.4-Butil-2,3,5,6-tetrafluoro-2''-jodo-2',4',6'-triizopropil-3''-hidroksi-1,1':3',1''-terfenilo
(20)sintezė 26
3.7.4-Butil-2,3,5,6-tetrafluoro-2''-jodo-2',4',6'-triizopropil-3''-izopropoksi-1,1':3',1''-
terfenilo (21) sintezė 26
3.8.4-Butil-2,3,5,6-tetrafluoro-2''-jodo-2',4',6'-triizopropil-3''-acetoksi-1,1':3',1''-terfenilo
(22) sintezė 27
3.9.4-Butil-2,3,5,6-tetrafluoro-2''-jodo-2',4',6'-triizopropil-3''-butanoiloksi-1,1':3',1''-
terfenilo (23) sintezė 28
3.10.4-Butil-2,3,5,6-tetrafluoro-2''-jodo-2',4',6'-triizopropil-3''-heksanoiloksi-1,1':3',1''-
terfenilo (24) sintezė 29
3.11.m-Terfenilesterių 22-24 hidrolizės reakcijos 29
3.12.m-Terfenolio 20 transesterinimo reakcijos 29
3.13.m-Terfenolio 20 esterinimo reakcijos 30
3.14.Fermentinių reakcijų mišinio paruošimas HPLC-MS ir GC-MS analizėms 30
3.15.Genų padauginimas PGR būdu 30
3.16.DNR elektroforezė 30
3.17.DNR gryninimas iš gelio 30
3.18.DNR fragmento klonavimas į pLATE31 vektorių 31
3.19.Bakterijų transformacija elektroporacijos būdu 31
3.20.Plazmidinės DNR gryninimas 31
3.21.Plazmidinės DNR hidrolizė restrikcijos endonukleazėmis 31
3.22.DNR sekoskaita 31
3.23.Genų raiškos indukcija 32
3.24.Ląstelių ardymas ultragarsu 32
3.25.Baltymų gryninimas chromatografijos sistema 32
3.26.Baltymų gryninimas centrifuguojamoje kolonėlėje 32
3.27.Baltymų elektroforezė denatūruojančiomis sąlygomis (SDS-PAGE) 32
3.28.Baltymų koncentracijos nustatymas Bradford metodu 33
4.REZULTATAI 34
4.1.Funkcionalizuoto m-terfenilo sintezė 34
4.1.1.Triizopropilbenzeno 25 monobrominimas 34
4.1.2.Bifenilo 16 sintezė 34
4.1.3.Bifenilo 17 sintezė 35
4.1.4.Jodido 18 sintezė 35
4.1.5.m-Terfenilo 19 sintezė 36
4.2.Funkcionalizuoto m-terfenilo cheminė modifikacija 37
4.2.1.m-Terfenolio 20 sintezė 37
4.2.1.m-Terfenolio 20 alkilinimas 38
4.2.1.m-Terfenolio 20 acilinimas 39
4.3.Fermentinė m-terfenilų modifikacija 40
4.3.1.PCLDk103 CE ir PCLDk103 PE genų klonavimas ir raiška, baltymų biosintezė ir
gryninimas 41
4.3.2.24T3 ir 30T2 esterazių ekspresija ir gryninimas 43
4.3.3.Skiediklio pasirinkimas reakcijoms su m-terfenilais 44

4.3.4.m-Terfenilesterių 22-24 hidrolizės reakcijos 44
4.3.5.Tirtų fermentų filogenetinė analizė 47
4.3.6.m-Terfenolio 20 transesterinimo reakcijos 49
4.3.7.m-Terfenolio 20 esterinimo reakcijos 49
4.3.8.Esterazių atropoizomerinis selektyvumas m-terfenilesteriams 22-24 50
5.IŠVADOS 51
6.LITERATŪRA 52
SANTRAUKA 57
SUMMARY 58
PRIEDAI 59
Priedas 1. Esterazių a.r. sekų palyginys 59
Priedas 2. UV-Vis spektrai 60
Priedas 3. Chiralinės HPLC chromatogramos 61

ĮVADAS
Fluorinti aromatiniai junginiai per pastarąjį šimtmetį tapo itin svarbūs farmacijos 1,2 ir žemės
ūkio pramonėse kaip efektyvesni bioaktyvių molekulių analogai. Dauguma metodų fluorintiems
aromatiniams junginiams gauti reikalauja aukštos temperatūros ir/ar slėgio, naudojami labai toksiški
ir reaktyvūs reagentai.
Šioms problemoms išspręsti galima panaudoti pereinamųjų metalų
katalizatorius. Paladžio (Pd) katalizuojamos kryžminio jungimo reakcijos jau plačiai naudojamos C-
C, C-heteroatomo ryšiams sudaryti.
Nors neseniai parodyta, kad Pd (0/II) katalizės pritaikymas C(sp2)-F ryšio sudaryme yra įmanomas, ši reakcija reikalauja elektronus traukiančio, erdviškai didelio fosfininio ligando. Taip pat, kol kas šios reakcijos substratų spektras aprėpia tik deaktyvuotus arilbromidus, jodidus ir triflatus.
Dauguma fosfininių ligandų, pritaikomų įvairių ryšių sudarymo katalizėje, pasižymi
atropoizomerija. Ši savybė yra panaudojama asimetrinėje katalizėje.
Ne maža dalis biologiškai aktyvių medžiagų taip pat pasižymi atropoizomerija. Nauji tyrimai rodo, kad gan dažnai tik vienas iš šių molekulių atropoizomerų yra biologiškai aktyvus.
Egzistuoja keli būdai atskirti atropoizomerus,
tačiau jie dažnai reikalauja specialių reagentų ar įrangos, didelių laiko sąnaudų ir yra neefektyvūs
dirbant didesnėse skalėse. Daugiausiai žadantis būdas – atskyrimui pritaikyti atropoizomeriniu
selektyvumu pasižyminčius fermentus.
Žinoma, kad tam tikros esterazės enantioselektyviai katalizuoja esterinimo ir esterių hidrolizės reakcijas su įvairiais atropoizomerija pasižyminčiais substratais.
Šiame darbe aprašyta funkcionalizuoto m-terfenilinio karkaso sintezė ir modifikacija bei
įvertintas MMBS atrinktų esterazių ir kelių komerciškai prieinamų esterazių aktyvumas ir
atropoizomerinis selektyvumas šiam funkcionalizuotam m-terfeniliniam karkasui.
Šio darbo tikslas – susintetinti modifikuotus m-terfenilinius karkasus, kurie, prijungus di-tert-
alkilfosfiną, bus pritaikyti Pd(0/II) katalizuojamuose C-F ryšio sudarymo reakcijose naudojant
skirtingus (hetero)aromatinius...