Funkcionalizuotų m-terfenilų sintezė, modifikacija ir chemofermentinis atropoizomerų atskyrimas

Ištrauka

Bakalauro baigiamasis darbas
Funkcionalizuotų m-terfenilų sintezė, modifikacija ir chemofermentinis atropoizomerų atskyrimas

TURINYS
TRUMPINIAI.......................................................................................................................................6
ĮVADAS................................................................................................................................................7
1. LITERATŪROS APŽVALGA...................................................................................................8
1.1. Fluorinti aromatiniai junginiai................................................................................................8
1.1.1. Klasikinė fluorintų (hetero)aromatinių junginių sintezė................................................8
1.1.2. Paladžio (0/II) katalizės pritaikymas C(sp2)-F kryžminio jungimo reakcijose..............8
1.2. Ašinis chirališkumas, atropoizomerija..................................................................................11
1.2.1. Atropoizomerija katalizėje...........................................................................................11
1.2.2. Ašinis chirališkumas biologijoje..................................................................................12
1.2.3. Ašinių enantiomerų atskyrimas....................................................................................13
1.3. Karboksilesterazės...................................................................................................................14
1.3.1. Alfa/beta hidrolazių struktūra ir veikimo mechanizmas..............................................15
1.3.2. Lipazių „dangčio“ motyvas.........................................................................................16
1.3.3. Lipazė iš Rhizomucor meihei.......................................................................................17
1.3.4. Lipazių pritaikymas atropoizomerų atskyrimui...........................................................17
2. REAGENTAI IR ĮRANGA.......................................................................................................19
2.1. Įranga biocheminiams darbams............................................................................................19
2.2. Rinkiniai...................................................................................................................................20
2.3. Tirpalai ir reagentai................................................................................................................20
2.4. Kamienai..................................................................................................................................21
2.5. DNR vektoriai..........................................................................................................................21
2.6. Auginimo terpės......................................................................................................................21
2.7. Pradmenys...............................................................................................................................22
3. METODAI..................................................................................................................................23
3.1.2-Bromo-1,3,5-triizopropilbenzeno (15) sintezė...................................................................23
3.2.2,3,4,5,6-Pentafluoro-2',4',6'-triizopropil-1,1'-bifenilo (16) sintezė....................................23
3.3.4-Butil-2,3,5,6-tetrafluoro-2',4',6'-triizopropil-1,1'-bifenilo (17) sintezė............................24
3.4.4-Butil-2,3,5,6-tetrafluoro-3'-jodo-2',4',6'-triizopropil-1,1'-bifenilo (18) sintezė..............24
3.5.4-Butil-2,3,5,6-tetrafluoro-2''-jodo-2',4',6'-triizopropil-3''-metoksi-1,1':3',1''-terfenilo
(19)sintezė......................................................................................................................................25
3.6.4-Butil-2,3,5,6-tetrafluoro-2''-jodo-2',4',6'-triizopropil-3''-hidroksi-1,1':3',1''-terfenilo
(20)sintezė......................................................................................................................................26
3.7.4-Butil-2,3,5,6-tetrafluoro-2''-jodo-2',4',6'-triizopropil-3''-izopropoksi-1,1':3',1''-
terfenilo (21) sintezė.......................................................................................................................26
3.8.4-Butil-2,3,5,6-tetrafluoro-2''-jodo-2',4',6'-triizopropil-3''-acetoksi-1,1':3',1''-terfenilo
(22) sintezė......................................................................................................................................27
3.9.4-Butil-2,3,5,6-tetrafluoro-2''-jodo-2',4',6'-triizopropil-3''-butanoiloksi-1,1':3',1''-
terfenilo (23) sintezė.......................................................................................................................28
3.10.4-Butil-2,3,5,6-tetrafluoro-2''-jodo-2',4',6'-triizopropil-3''-heksanoiloksi-1,1':3',1''-
terfenilo (24) sintezė.......................................................................................................................29
3.11.m-Terfenilesterių 22-24 hidrolizės reakcijos......................................................................29
3.12.m-Terfenolio 20 transesterinimo reakcijos.........................................................................29
3.13.m-Terfenolio 20 esterinimo reakcijos..................................................................................30
3.14.Fermentinių reakcijų mišinio paruošimas HPLC-MS ir GC-MS analizėms..................30
3.15.Genų padauginimas PGR būdu...........................................................................................30
3.16.DNR elektroforezė.................................................................................................................30
3.17.DNR gryninimas iš gelio.......................................................................................................30
3.18.DNR fragmento klonavimas į pLATE31 vektorių.............................................................31
3.19.Bakterijų transformacija elektroporacijos būdu...............................................................31
3.20.Plazmidinės DNR gryninimas..............................................................................................31
3.21.Plazmidinės DNR hidrolizė restrikcijos endonukleazėmis................................................31
3.22.DNR sekoskaita.....................................................................................................................31
3.23.Genų raiškos indukcija.........................................................................................................32
3.24.Ląstelių ardymas ultragarsu................................................................................................32
3.25.Baltymų gryninimas chromatografijos sistema.................................................................32
3.26.Baltymų gryninimas centrifuguojamoje kolonėlėje...........................................................32
3.27.Baltymų elektroforezė denatūruojančiomis sąlygomis (SDS-PAGE)..............................32
3.28.Baltymų koncentracijos nustatymas Bradford metodu....................................................33
4.REZULTATAI...........................................................................................................................34
4.1.Funkcionalizuoto m-terfenilo sintezė....................................................................................34
4.1.1.Triizopropilbenzeno 25 monobrominimas...................................................................34
4.1.2.Bifenilo 16 sintezė.......................................................................................................34
4.1.3.Bifenilo 17 sintezė.......................................................................................................35
4.1.4.Jodido 18 sintezė.........................................................................................................35
4.1.5.m-Terfenilo 19 sintezė.................................................................................................36
4.2.Funkcionalizuoto m-terfenilo cheminė modifikacija...........................................................37
4.2.1.m-Terfenolio 20 sintezė...............................................................................................37
4.2.1.m-Terfenolio 20 alkilinimas.........................................................................................38
4.2.1.m-Terfenolio 20 acilinimas..........................................................................................39
4.3.Fermentinė m-terfenilų modifikacija....................................................................................40
4.3.1.PCLDk103 CE ir PCLDk103 PE genų klonavimas ir raiška, baltymų biosintezė ir
gryninimas...................................................................................................................................41
4.3.2.24T3 ir 30T2 esterazių ekspresija ir gryninimas.........................................................43
4.3.3.Skiediklio pasirinkimas reakcijoms su m-terfenilais...................................................44

4.3.4.m-Terfenilesterių 22-24 hidrolizės reakcijos...............................................................44
4.3.5.Tirtų fermentų filogenetinė analizė..............................................................................47
4.3.6.m-Terfenolio 20 transesterinimo reakcijos..................................................................49
4.3.7.m-Terfenolio 20 esterinimo reakcijos..........................................................................49
4.3.8.Esterazių atropoizomerinis selektyvumas m-terfenilesteriams 22-24.........................50
5.IŠVADOS....................................................................................................................................51
6.LITERATŪRA...........................................................................................................................52
SANTRAUKA....................................................................................................................................57
SUMMARY........................................................................................................................................58
PRIEDAI.............................................................................................................................................59
Priedas 1. Esterazių a.r. sekų palyginys..........................................................................................59
Priedas 2. UV-Vis spektrai.............................................................................................................60
Priedas 3. Chiralinės HPLC chromatogramos................................................................................61

ĮVADAS
Fluorinti aromatiniai junginiai per pastarąjį šimtmetį tapo itin svarbūs farmacijos 1,2 ir žemės
ūkio pramonėse kaip efektyvesni bioaktyvių molekulių analogai. Dauguma metodų fluorintiems
aromatiniams junginiams gauti reikalauja aukštos temperatūros ir/ar slėgio, naudojami labai toksiški
ir reaktyvūs reagentai.
Šioms problemoms išspręsti galima panaudoti pereinamųjų metalų
katalizatorius. Paladžio (Pd) katalizuojamos kryžminio jungimo reakcijos jau plačiai naudojamos C-
C, C-heteroatomo ryšiams sudaryti.
Nors neseniai parodyta, kad Pd (0/II) katalizės pritaikymas C(sp2)-F ryšio sudaryme yra įmanomas, ši reakcija reikalauja elektronus traukiančio, erdviškai didelio fosfininio ligando. Taip pat, kol kas šios reakcijos substratų spektras aprėpia tik deaktyvuotus arilbromidus, jodidus ir triflatus.
Dauguma fosfininių ligandų, pritaikomų įvairių ryšių sudarymo katalizėje, pasižymi
atropoizomerija. Ši savybė yra panaudojama asimetrinėje katalizėje.
Ne maža dalis biologiškai aktyvių medžiagų taip pat pasižymi atropoizomerija. Nauji tyrimai rodo, kad gan dažnai tik vienas iš šių molekulių atropoizomerų yra biologiškai aktyvus.
Egzistuoja keli būdai atskirti atropoizomerus,
tačiau jie dažnai reikalauja specialių reagentų ar įrangos, didelių laiko sąnaudų ir yra neefektyvūs
dirbant didesnėse skalėse. Daugiausiai žadantis būdas – atskyrimui pritaikyti atropoizomeriniu
selektyvumu pasižyminčius fermentus.
Žinoma, kad tam tikros esterazės enantioselektyviai katalizuoja esterinimo ir esterių hidrolizės reakcijas su įvairiais atropoizomerija pasižyminčiais substratais.
Šiame darbe aprašyta funkcionalizuoto m-terfenilinio karkaso sintezė ir modifikacija bei
įvertintas MMBS atrinktų esterazių ir kelių komerciškai prieinamų esterazių aktyvumas ir
atropoizomerinis selektyvumas šiam funkcionalizuotam m-terfeniliniam karkasui.
Šio darbo tikslas – susintetinti modifikuotus m-terfenilinius karkasus, kurie, prijungus di-tert-
alkilfosfiną, bus pritaikyti Pd(0/II) katalizuojamuose C-F ryšio sudarymo reakcijose naudojant
skirtingus (hetero)aromatinius substratus, bei įvertinti skirtingų esterazių aktyvumą ir
atropoizomerinį enantioselektyvumą naudojant šį m-terfenilą kaip substratą.
Uždaviniai:
Susintetinti ir chemiškai modifikuoti funkcionalizuotą m-terfenilinį karkasą.
Įvertinti skirtingų esterazių hidrolizinį bei (trans)esterinį aktyvumus bei atropoizomerinį
selektyvumą su modifikuotu m-terfeniliniu substratu.