Amiloidinių baltymų α-sinukleino ir S100A9 neurotoksinio poveikio mechanizmo mikroglijos ląstelėms tyrimas

Ištrauka

Amiloidinių baltymų α-sinukleino ir S100A9 neurotoksinio poveikio mechanizmo mikroglijos ląstelėms tyrimas
Baigiamasis magistro projektas

Turinys
Santrumpų sąrašas 10
Įvadas 12
1. Literatūros apžvalga 14
1.1. α-sinukleinas: struktūra, funkcijos ir neurotoksinio poveikio mechanizmai 14
1.2. S100A9: struktūra, funkcijos ir neurotoksinio poveikio mechanizmai 19
1.3. Endotoksino lipopolisacharido hipotezė 21
1.4. Mikroglijos reikšmė neurouždegiminiame procese 23
1.4.1. Mikroglija ir jos funkcijos 23
1.4.2. Mikroglijos fenotipai ir jų skirstymas 25
1.4.3. Mikroglijos bioenergetika ir metabolinis perprogramavimas 26
1.5. Literatūros apžvalgos apibendrinimas ir projekto temos bei uždavinių pagrindimas 29
2. Medžiagos ir tyrimų metodai 30
2.1. Tyrimams naudotos medžiagos ir reagentai 30
2.2. Tyrimams naudota laboratorinė įranga 31
2.3. Tyrimų metodai 31
2.3.1. Imortalizuotos pelių mikroglijos BV-2 ląstelių kultūros kultivavimas 31
2.3.2. Ląstelių skaičiavimas ir jų gyvybingumo įvertinimas tripano mėliu 32
2.3.3. Lipopolisacharido, α-sinukleino ir S100A9 paruošimas neurotoksiškumo tyrimams ir 
ląstelių kultūros inkubacija su tiriamomis medžiagomis 33
2.3.4. Ląstelių kvėpavimo greičio registravimas 33
2.3.5. Ląstelių glikolitinio aktyvumo vertinimas 34
2.3.6. Azoto monoksido auginimo terpėje kiekybinis įvertinimas 35
2.3.7. Prouždegiminio citokino TNF-α auginimo terpėje kiekybinis įvertinimas 36
2.3.8. Aktyvių deguonies junginių auginimo terpėje kiekybinis įvertinimas 36
2.3.9. Statistinė duomenų analizė 37
3. Tyrimų rezultatai ir jų aptarimas 38
3.1. α-sinukleino poveikis nepermeabilizuotų ir permeabilizuotų BV-2 ląstelių kvėpavimo 
greičiui 38
3.2. S100A9 poveikis nepermeabilizuotų ir permeabilizuotų BV-2 ląstelių kvėpavimo greičiui 40
3.3. Lipopolisacharido poveikis nepermeabilizuotų ir permeabilizuotų BV-2 ląstelių kvėpavimo 
greičiui 42
3.4. α-sinukleino ir S100A9 poveikis BV-2 ląstelių glikolitiniam aktyvumui 45
3.5. Lipopolisacharido poveikis BV-2 ląstelių glikolitiniam aktyvumui 47
3.6. α-sinukleino, S100A9 ir lipopolisacharido poveikio įtaka azoto monoksido susidarymui 
terpėje 49
3.7. α-sinukleino, S100A9 ir lipopolisacharido poveikio įtaka TNF-α koncentracijai terpėje 51
3.8. α-sinukleino, S100A9 ir lipopolisacharido poveikio įtaka aktyvių deguonies junginių 
susidarymui terpėje 53
Rekomendacijos 56
Išvados 57
Literatūros sąrašas 58
Publikacijų sąrašas 81
Priedai 82

Įvadas
Su amžiumi susijusios neurodegeneracinės ligos, tokios kaip Alzheimerio liga (AL) ir Parkinsono
liga (PL) – didelė ir opi visuomenės sveikatos problema dėl nuolatos prastėjančios epidemiologinės
situacijos ir terapinių priemonių ribotumo [1]. PL pasaulyje serga virš 10 mln. žmonių [2], o ilgėjant
vidutinei gyvenimo trukmei šia liga sergančių pacientų skaičius labai sparčiai auga. Manoma, jog
2040 m. gali pasiekti net 17,5 mln. [3]. Neurodegeneracinių ligų grupei yra būdingas netaisyklingas
amiloidinių baltymų susilankstymas, jų agregacija į įvairaus dydžio sankaupas bei kaupimasis
ląstelėse ir už jos ribų specifiniuose smegenų regionuose. Tai sąlygoja oksidacinį stresą, lėtinį
uždegimą, paveiktų neuronų disfunkciją ir sinapsių nykimą [1]. Pagrindiniai PL požymiai –
amiloidinio baltymo α-sinukleino (αSyn) sankaupos dėl agregacijos į stambesnius junginius:
oligomerus, protofibriles, fibriles ir Lewy kūnelius, bei laipsniška dopaminerginių neuronų
degeneracija smegenų juodosios medžiagos tankiojoje dalyje. Dėl to pasireiškia įvairūs klinikiniai
motoriniai ir nemotoriniai simptomai: tremoras, bradikinezija, rigidiškumas, miego sutrikimai,
vidurių užkietėjimas, depresija, kognityvinių funkcijų sutrikimai ir kt. [4]. PL atveju tradiciškai yra
labiausiai išskiriamas toksiškus agregatus sudarantis αSyn, o AL atveju – β amiloidas (Aβ) ir tau,
tačiau naujausi tyrimai rodo, kad įvairių rūšių amiloidiniai baltymai ir jų tarpusavio sąveika
persidengia skirtingų neurodegeneracinių ligų patogenezėje [5–7]. Pavyzdžiui, kalcio jonus (Ca2+)
prijungiantis amiloidinis baltymas S100A9, kurio padidėjusi koncentracija anksčiau buvo nustatyta
AL paveiktų smegenų lizatuose ir mikroglijose [8], geba skatinti αSyn agregaciją ir yra randamas
koagregatuose kartu su αSyn PL sergančiųjų smegenyse [9]. Tačiau, koks yra šios sąveikos
vaidmuo PL patogenezėje, kuris iš šių baltymų, αSyn ar S100A9, ir kokia jų agregatinė forma
pasižymi didžiausiu citotoksiškumu, duomenų yra mažai arba mokslininkų nuomonės išsiskiria.
Taip pat kyla daug diskusijų, ar amiloidinių baltymų agregacija yra neurodegeneracinių ligų
patogenezės centre, nes nei vienas iš PL klinikinių tyrimų,...